De ce 99% puritate HPLC nu înseamnă 99% peptidă în flacon

Pe certificatul unui lot scrie 99%. Punem pulberea pe balanță și ne interesează altceva: din miligramul cântărit, cât este peptidă? Răspunsul nu e 99%, și nu pentru că cineva ar fi greșit analiza. Cele două numere măsoară lucruri diferite, iar între ele stau două componente pe care cromatograma nu le numără, contraionii și apa.

Ce numără, de fapt, cei 99%

Puritatea HPLC este un raport de arii. Aria vârfului principal se împarte la suma ariilor tuturor vârfurilor integrate pe cromatogramă, la o detecție în ultraviolet de 214–220 nm, unde absoarbe legătura peptidică. La numitor intră deci peptida țintă și impuritățile înrudite cu ea: lanțuri mai scurte, lanțuri cu un aminoacid lipsă, forme oxidate.

Atât. Tot ce nu apare ca vârf integrat rămâne în afara raportului. O probă poate avea 99% puritate și, în același timp, o parte bună din masa ei poate fi altceva decât peptidă. Nu e nicio contradicție aici, sunt două întrebări diferite puse aceleiași pulberi.

De unde vin contraionii

O peptidă are grupări bazice: amina de la capătul N-terminal și catenele laterale ale lizinei, argininei și histidinei. În mediu acid, ele sunt protonate și poartă sarcină pozitivă. O sarcină pozitivă nu stă singură într-un solid. Lângă fiecare se așază un ion negativ, iar acesta e contraionul. Peptida liofilizată este, chimic vorbind, o sare.

Trifluoracetatul

Acidul trifluoracetic (TFA) apare de două ori în fabricarea unei peptide sintetice. Cu el se desprinde, în mod obișnuit, lanțul de pe rășină la finalul sintezei pe fază solidă, și tot el este aditivul uzual din faza mobilă apă/acetonitril cu care se face purificarea pe coloană C18. La liofilizare, acidul liber pleacă în mare parte, fiind volatil. Ionii trifluoracetat legați de grupările bazice rămân. De aceea forma „implicită” a multor peptide de cercetare este sarea de TFA.

Acetatul

Printr-un pas separat de schimb ionic, trifluoracetatul poate fi înlocuit cu acetat. Unele laboratoare cer forma aceasta pentru lucrul pe culturi celulare, unde TFA rezidual poate influența rezultatul anumitor teste. Din punctul de vedere al masei, diferența e simplă: acidul acetic are masa molară de aproximativ 60 g/mol, acidul trifluoracetic de aproximativ 114 g/mol. Același număr de contraioni cântărește aproape dublu când sunt trifluoracetat.

O socoteală pe o peptidă inventată

Luăm o peptidă ipotetică de 1000 g/mol, cu trei grupări bazice. Cifrele sunt alese ca să fie ușor de urmărit, nu descriu un lot real.

Dacă fiecare grupare bazică poartă câte un trifluoracetat, la un mol de peptidă se adaugă 3 × 114, adică 342 g de contraion. Sarea cântărește 1342 g, din care peptida este 1000. Cam un sfert din masă e TFA. Cu acetat, aceeași peptidă ar căra 3 × 60, adică 180 g la 1180, în jur de 15%.

Calculul presupune că toate cele trei grupări sunt ocupate, ceea ce în practică nu se întâmplă mereu, așa că îl luăm ca pe o limită de sus. Arată totuși de ce contează secvența. O peptidă cu multe resturi bazice poartă mai mult contraion decât una cu puține. Selank, de pildă, are în lanțul lui de șapte aminoacizi o lizină și o arginină, la care se adaugă amina terminală, deci trei locuri unde se poate așeza un contraion. Peptida apare și în catalogul PEPTIDÁE, la fișa de produs Selank. Cât contraion are un lot anume nu se deduce însă din secvență. Se măsoară, de obicei prin cromatografie ionică.

Apa care rămâne după liofilizare

Liofilizarea scoate apa prin sublimare, dar nu pe toată. O parte rămâne legată de peptidă. Pe deasupra, pulberea liofilizată este higroscopică, adică trage umezeală din aer de fiecare dată când flaconul stă deschis. Un lot cântărit într-o zi umedă poate arăta altfel decât același lot cântărit imediat după scoaterea din exsicator.

Conținutul de apă se determină prin titrare Karl Fischer și apare pe unele certificate ca rând separat. Felul în care e păstrat flaconul influențează direct cifra aceasta.

Puritate și conținut net, puse una lângă alta

Conținutul net de peptidă este fracția din masa pulberii care e material peptidic, restul fiind contraioni și apă. Se determină prin analiza aminoacizilor după hidroliză sau prin analiză elementală de azot. De obicei iese undeva între 60 și 90%, în funcție de secvență și de forma de sare.

În „material peptidic” intră și impuritățile peptidice. Ca să ajungem la peptida țintă, înmulțim cele două numere. Un exemplu, tot construit: conținut net 80%, puritate HPLC 99%. Din masa cântărită, peptida țintă reprezintă 0,80 × 0,99, adică 79,2%. Nu 99.

Pentru cine ține evidența loturilor, urmarea e practică. Două loturi cu aceeași puritate pot avea conținut net diferit, iar atunci aceeași masă pe balanță înseamnă cantități diferite de peptidă. Un rezultat raportat la masa de pulbere este raportat, de fapt, la peptidă plus sare plus apă. Când comparăm serii de date obținute pe loturi diferite, aici căutăm întâi explicația unei diferențe mici și constante.

Mai e întrebarea cantității de pe etichetă. Uneori ea înseamnă masa brută de pulbere, alteori masa netă de peptidă. Certificatul ar trebui să lămurească, iar dacă nu o face, întrebăm furnizorul. Pentru celelalte verificări legate de puritate, pe blogul aceluiași site există un articol despre criteriile de verificare a purității. Noi trecem în caietul de laborator, lângă numărul lotului, trei valori când le avem: puritatea, conținutul net și forma de sare.