Cum citim o cromatogramă HPLC a unei peptide

O cromatogramă e un desen simplu. O linie aproape dreaptă, un vârf înalt, câteva denivelări. Cine o vede prima dată într-un certificat trece de obicei direct la procentul scris dedesubt, iar nouă ni se pare păcat, pentru că desenul spune mai mult decât cifra și, în același timp, mai puțin decât pare. Luăm pe rând ce se vede pe el atunci când proba este o peptidă de cercetare.

Ce e pe cele două axe

Pe orizontală e timpul, în minute, măsurat din clipa în care proba a fost injectată în coloană. Pe verticală e răspunsul detectorului, adică absorbanța în ultraviolet, exprimată de obicei în miliunități de absorbanță (mAU).

La peptide, metoda obișnuită este cromatografia de lichide în fază inversă (RP-HPLC). Coloana e umplută cu silice de care sunt legate lanțuri C18, hidrofobe. Faza mobilă e un amestec de apă și acetonitril, cu puțin acid trifluoracetic (TFA), iar proporția de acetonitril crește treptat pe durata rulării. Asta numim gradient. Moleculele mai hidrofobe se țin mai strâns de coloană și ies mai târziu, când solventul organic ajunge destul de concentrat cât să le desprindă.

Detectorul citește la 214–220 nm. Acolo absoarbe legătura peptidică însăși, deci orice lanț de aminoacizi dă semnal. La 280 nm ar răspunde doar secvențele cu triptofan sau tirozină, iar restul ar trece nevăzute.

Vârful principal și timpul lui de retenție

Vârful cel mai înalt (peak) este, în mod normal, peptida țintă. Momentul în care atinge maximul se numește timp de retenție (retention time).

Timpul de retenție nu este o proprietate a peptidei. Este o proprietate a peptidei în metoda aceea: aceeași coloană, același gradient, aceeași temperatură, același debit. Schimbăm panta gradientului și vârful se mută. De aceea nu are rost să comparăm minutul de pe cromatograma unui furnizor cu minutul de pe a altuia. Are rost, în schimb, să punem alături două loturi analizate cu aceeași metodă. Dacă vârful principal apare în același loc, e un prim semn de consistență.

Ne uităm și la formă. Un vârf îngust și simetric arată o separare curată. Un „umăr” pe o latură poate însemna că sub vârf stau două substanțe ieșite aproape împreună. Coada lungă e mai greu de judecat, fiindcă uneori vine de la coloană, nu de la probă.

Vârfurile mici de lângă el

Sinteza pe fază solidă adaugă aminoacizii unul câte unul și niciun pas nu merge până la capăt pentru toate moleculele. Rămân lanțuri cărora le lipsește un aminoacid, lanțuri oprite înainte de final, lanțuri de pe care nu s-a desprins o grupare protectoare. Peste ele vin produșii de degradare, cum ar fi oxidarea metioninei sau dezamidarea asparaginei.

Toate seamănă chimic cu peptida țintă, așa că ies aproape de ea, puțin înainte sau puțin după. Un exemplu la îndemână este o peptidă scurtă cu metionină în secvență, cum e cea din fișa Semax din catalogul PEPTIDÁE. La orice moleculă de felul acesta, forma oxidată este mai polară și apare, de regulă, ceva mai devreme decât vârful principal.

Două lucruri de pe desen nu sunt impurități. Primul e semnalul din primele minute, unde ies solventul probei și tot ce nu se reține pe coloană. Al doilea e linia de bază care urcă sau coboară ușor pe parcursul gradientului, pentru că TFA absoarbe și el la lungimi de undă mici, iar compoziția fazei mobile se schimbă de la un minut la altul. De obicei, niciunul nu intră în calcul.

Cum iese procentul din arii

Programul cromatografului trasează o linie de bază sub fiecare vârf și calculează aria dintre vârf și linie. Puritatea HPLC este aria vârfului principal împărțită la suma ariilor tuturor vârfurilor integrate, înmulțită cu o sută. Mai jos e un exemplu construit de noi, cu cifre rotunde, doar ca să se vadă socoteala.

Puritatea raportată ar fi 98,2%. Metoda se numește procent de arie și se sprijină pe o presupunere: toate componentele absorb la fel de bine la lungimea de undă aleasă. Pentru impuritățile înrudite cu peptida, presupunerea e rezonabilă, fiindcă au aproape același număr de legături peptidice. Exactă nu este.

Cifra depinde și de felul în care s-a integrat. Un prag de detecție mai ridicat lasă pe dinafară vârfurile foarte mici, iar puritatea crește pe hârtie fără ca proba să se fi schimbat. Un gradient prea abrupt înghesuie impuritățile sub vârful principal și le ascunde. Când avem de comparat două procente, ne uităm întâi dacă metodele seamănă.

Ce nu spune cromatograma

Nu spune ce substanță e în vârf. Timpul de retenție arată cât de hidrofobă e molecula în condițiile date, atât. Două peptide diferite pot ieși în același minut. Identitatea o confirmă spectrometria de masă, care măsoară masa moleculară și o compară cu cea calculată din secvență. Despre felul în care se completează cele două metode există un text pe blogul aceluiași site, cel despre HPLC și spectrometrie în controlul purității.

Nu spune nici câtă peptidă e în flacon. Cei 98,2% din exemplu înseamnă că, din tot ce a absorbit în ultraviolet și a fost integrat, 98,2% e vârful principal. Apa rămasă după liofilizare și contraionii care însoțesc peptida ca sare nu apar printre vârfurile numărate. Masă au, totuși. Conținutul net de peptidă se determină separat, prin alte analize, și este de regulă mai mic decât puritatea.

Și tace despre ce nu dă semnal la detector, cum sunt sărurile anorganice.

Când cromatograma vine fără context

O imagine decupată, fără antet, ne ajută puțin. Pe o cromatogramă completă apar numele probei sau numărul lotului, data rulării, lungimea de undă și, sub desen, tabelul vârfurilor cu timpii și ariile lor. Fără tabel, cititorul nu poate reface procentul. Fără numărul lotului, nu știm a cui e proba.

Noi avem un obicei simplu: tipărim cromatograma și notăm pe margine coloana, gradientul și lungimea de undă. Cu două foi alăturate, din loturi diferite și cu aceeași metodă, comparația durează un minut.